El microscopio de fluorescencia es un tipo de microscopio óptico, generalmente el objeto a observar es transparente, o la estructura interna no se puede distinguir bien del color, entonces el microscopio de fluorescencia es una buena opción para resolver el problema de que el microscopio ordinario no puede observar el material transparente. El principio del microscopio de fluorescencia es utilizar luz de longitud de onda corta para irradiar el objeto examinado que ha sido coloreado con fluoresceína, de modo que se excitará para producir fluorescencia de longitud de onda larga, permitiendo así al observador observar la estructura interna de la muestra. En la microscopía de fluorescencia, debe seleccionarse una longitud de onda específica de la luz de excitación de la iluminación de la muestra para producir fluorescencia y, a continuación, debe separarse la fluorescencia de la mezcla de luz de excitación y fluorescencia para su observación. Por lo tanto, el sistema de filtros desempeña un papel extremadamente importante en la selección de una longitud de onda específica. Los microscopios de fluorescencia se utilizan ampliamente en los campos biológico y médico.
Un microscopio de fluorescencia incluye los siguientes componentes básicos:
a. Fuente de luz: normalmente lámparas de arco de xenón o lámparas de mercurio, pero en los últimos años también se han utilizado LED de alta potencia.
b. Filtro (luz incidente): reduce la longitud de onda de la luz incidente para dejar sólo la longitud de onda utilizada para excitar la muestra, lo que curiosamente se denomina filtro de excitación.
c. Espejo dicroico o reflector: Refleja la luz de excitación sobre la muestra y, al mismo tiempo, hace pasar al detector sólo la luz emitida por la muestra (como se muestra a continuación).
d. Filtro (Emisión): pasa sólo la longitud de onda de la luz de emisión de la muestra y bloquea toda la luz que pasa a través del filtro de excitación, que, como es de esperar, se llama filtro de emisión.
e. Cámara CCD: La luz emitida no sirve de nada si no se puede detectar; para la obtención de imágenes de fluorescencia, el detector suele ser una cámara CCD, que también suele estar conectada a una pantalla de ordenador que puede presentarle una imagen.
Los espejos dicroicos permiten que las longitudes de onda más largas pasen a través del filtro y reflejan las más cortas.
Clasificación de la microscopía de fluorescencia:
Los microscopios de fluorescencia se clasifican generalmente en dos tipos: de transmisión y de precipitación:
a. Transmisivo: la luz de excitación proviene de debajo del objeto examinado, y la lente de puntería es una lente de puntería de campo oscuro, de modo que la luz de excitación no entra en la lente del objetivo, pero la fluorescencia entra en la lente del objetivo. Es brillante a bajo aumento, mientras que el alto aumento es oscuro, en la inmersión en aceite y sintonización, más difícil de operar, especialmente a bajo aumento de la gama de iluminación es difícil de determinar, pero puede obtener un campo muy oscuro de la vista del fondo. El tipo de transmisión no se utiliza para objetos examinados no transparentes.
b. Tipo de caída: El tipo de transmisión está casi eliminado en la actualidad, el nuevo microscopio de fluorescencia es en su mayoría de tipo de caída, la fuente de luz es de la parte superior del objeto examinado, y hay un espejo de división de haz en el camino óptico, por lo que es adecuado tanto para objetos examinados transparentes y opacos. Como la lente del objetivo desempeña el papel de lente de enfoque, no sólo es fácil de manejar, sino que además, desde un aumento bajo hasta un aumento alto, puede lograr una iluminación uniforme de todo el campo de visión.
Trayectoria óptica típica de un microscopio de fluorescencia de luz descendente